一篇小CDD告诉你如何让miRNA研究“更精致” | miRNA专题

miRNA对于联川生物的忠实粉丝再熟悉不过了，当然大家对miRNA的研究也非常熟悉，我们通常会选择文章中没有报道的miRNA分子，之后进行生物信息学预测靶基因，然后通过WB或者qpcr检测靶基因和miRNA之间的负调控的关系，当然再加上双荧光素酶报告实验，这些都是非常经典的研究miRNA分子套路，以前是非常容易发在5分甚至是10分的杂志上，现如今是非常难了。除了我们之前联川生物一篇miRNA跨界调控思路的解析（深受读者好评）当然还有很多miRNA的新的调控，比如miRNA启动子本身的甲基化，lncRNA作为miRNA的前体（precursor）等等会让小RNA的研究锦上添花，那么问题就来了，如何让小RNA研究的更精致，重新发到5分以上呢?让我们看看这篇2020年发表在小CDD的miRNA的文章，告诉您精致后的miRNA研究会更出彩。

01

研究背景之这么多年绕过不去的肿瘤

在临床上,肿瘤的化疗耐药经常导致治疗失败,迫切需要发现新的治疗策略.本文章就是围绕miRNA-93在体内外均能显著抑制癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞于G1/S期，并增加紫杉醇(PTX)的化疗敏感性,并有可能成为乳腺癌的一个新的治疗靶点。

02一图读懂MiR-93调节耐药的工作模式

整个图不难理解首先作者通过研究发现MCM7基因的甲基化和miR-93表达量的关系，（MCM7微小染色体维持蛋白(miIlichmmmaintemcepmtein,Mcm)家族成员之一,参与调控真核生物DNA的复制起始和延伸过程），MCM7又是和细胞周期、凋亡相关的基因，难道他们之间还存在调控关系，（其实并不然），但是有理由相信MiR-93调控的模式并不简单，之后作者通过体内体外验证寻找miRNA的靶基因和一步步揭开miR-93的神秘面纱。

03MiR-93精致调控的前因、过程、和结论

研究MiR-93要找到研究的理由

1.MiR-93的下调是由于其宿主基因MCM7的高度甲基化导致

亲代(BCap37)和化疗耐药(BATS-72)乳腺癌细胞系之间的DEmiRNAs火山图；miR-93,它在BATS-72中的表达与BCap37相比显著降低

miR-93在两个耐药细胞系中表达下调,特别是在BADS-200；肿瘤组织中miR-93的表达较低；肿瘤样本中miR-93启动子位点发生了显著的高甲基化

miR-93的启动子甲基化速率与miR-93及其宿主基因MCM7的表达呈负相关

研究MiR-93大胆的猜想很有可能和增殖细胞周期相关

2.MIR-93抑制乳腺癌细胞增殖、诱导G1/S期阻滞以及增强PTX诱导的乳腺癌细胞凋亡

miR-93过表达显著抑制了BCap37、Bats-72和Bads-200的细胞增殖

克隆形成试验进一步证实miR-93降低了乳腺癌细胞的克隆形成能力

miR-93可诱导G1/S期阻滞,使G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低

miR-93显著降低PTX的IC50

过表达miR-93可增加对其他一线抗癌药物的敏感性

miR-93显著促进BCap37、BATS-72和Bads-200细胞的凋亡,无论是否有PTX

MiR-93难道会抑制成瘤？

3.MIR-93体内抑制肿瘤形成及提高PTX疗效的实验研究

用稳定表达NC/miR-93的Bads-200细胞建立皮下肿瘤模型，并用PBS/PTX进行后续治疗, 过表达miR-93的异种移植瘤的miR-93表达水平比NC高~8倍

MIR-93显著减小肿瘤体积和重量，特别是在miR-93和PTX联合治疗组

H&E和Ki67染色表明miR-93的过表达抑制了细胞的增殖

MiR-93调控靶基因经典的研究方式，解决为什么是这样

4.E2F1和CCND1是miR-93的两个靶基因,它们与乳腺癌的化疗耐药呈正相关

四个数据库中都包含210个目标基因;12个候选靶基因中,E2F1和CCND1被miR-93显著下调
与临床标本配对的邻近正常组织相比,E2F1和CCND1在肿瘤组织中过表达,对TCGA样本的分析进一步证实了E2F1和CCND1在肿瘤样本中的高表达

在Bad-200细胞中进行双荧光素酶检测,Mir-93显著下调Bads-200细胞中E2F1和CCND1的蛋白水平，无论加或不加PTX

Bads-200异种移植瘤图，E2F1和CCND1的IHC染色, 与Bad-200异种移植小鼠的IHC结果一致

E2F1和CCND1的mRNA和蛋白水平在化疗耐药细胞系中上调,表明E2F1和CCND1与化疗耐药呈正相关

5.   E2F1和CCND1通过pRb/E2F1途径阻断miR-93对细胞增殖和细胞周期进程的抑制作用

生长曲线显示E2F1/CCND1过表达提高了BCap37细胞的活力

miR-93可以逆转E2F1/CCND1诱导的G1/S细胞周期转变的促进作用

CCND1在BCap37细胞中的过表达激活了PRB/E2F1的磷酸化

miR-93的过表达显著抑制了这些E2F1靶标;在Bads-200细胞中,E2F1/CCND1的下调也抑制了这些E2F1靶标的表达

MiR-93调控靶基因和什么通路的激活抑制相关，更深一步机制探讨

6.  MIR-93通过抑制E2F1/CCND1活性和AKT磷酸化促进细胞凋亡

过表达E2F1/CCND1提高了BCap37细胞中PTX的IC50,而E2F1/CCND1基因敲除则提高了Bads-200细胞对PTX的敏感性

MIR-93可阻止E2F1/CCND1介导的Bad-200细胞凋亡减少

在Bads-200细胞中,miR-93还能抑制AKT(Pakt)和抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-xl)的磷酸化,但增加促凋亡蛋白(Bax)的水平;在BCap37细胞中过表达E2F1/CCND1增加了pakt、Bcl-2、Bcl-xl,降低了Bax

04总结

通过上述介绍文章思路非常清晰的介绍了为什么研究MIR-93，MIR-93的生物学功能表现在哪些方面，MIR-93为什么会实现这样的生物学功能，一步步揭示了MIR-93的神秘面纱，文章中涉及了一系列的经典的生物学实验，严谨的思路才发表在当红的小CDD的文章中，不亏是研究精致的一篇miRNA的好文章，最后呢小编给联川生物的miRNA分析打个广告，miRNA分析哪里棒，联川生物属最强，欢迎大家联系项目经理前来咨询哈。

相关阅读